前言在进行自噬研究时，WB 检测 LC3-I 和 LC3-II 几乎是必做的实验，那么，进行 LC3 检测时，需要注意哪些要点呢？你的实验方案真的没有问题吗？下面我们来具体看一下实验方案的设计易错点。LC3: 从何处来？往何处去？LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的 Atg4 在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I 通过 Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使 PtdEth（PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体 (autophagosome) 的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的 LC3-II 被半胱氨酸蛋白酶 Atg4B 移除后回收，位于内膜的 LC3-II 则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。LC3A/B/C 有种属细胞/组织分布特点LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的 Atg4 在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I 通过 Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，PtdEth(PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体 (autophagosome) 的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的 LC3-II 被半胱氨酸蛋白酶 Atg4B 移除后回收，位于内膜的 LC3-II 则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。哺乳动物 LC3 蛋白的四个亚型（LC3A, LC3B,LC3B2 和 LC3C），他们的表达因组织或细胞类型而异。如图 2 所示，在甲状腺（Thyroid，第一行）中，LC3B 的表达水平并不高，检测 LC3A 更为合适。所以，需要根据自己使用的细胞系或者组织的情况，使用合适的靶标抗体。当然，通过使用抗 LC3A/B 抗体，同时检测 LC3A 和 LC3B，可以大大增加实验的成功率。 LC3 的来去是一个动态过程——检测 PCR 意义并不大，做 wb 也不能只简单检测就了事正如前言所述，LC3-I 和 II 存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程，即「自噬流」。所以，单时间点 LC3-II 的表达改变并不能体现自噬的改变，需要使用一些阻断溶酶体降解的药物（如氯喹、巴佛洛霉素 A1 等），判断在干预手段下，细胞的自噬程度的改变。氯喹可以通过抑制溶酶体功能（比如升高它的 pH 值），抑制 LC3-II 的降解；巴佛洛霉素 A1 则是一种强效 V-ATPase 抑制剂，阻断溶酶体依赖的降解。在「堵漏」的前提下，根据一段时间内 LC3-II 的积聚程度，判断自噬的改变（图 3）。 图 3：干预条件下，LC3 印记结果示例（摘自文献 3）a 组，LC3-II 在 a 处理下表达升高，使用 Baf A1 后，进一步升高，提示自噬流的升高；b 组，LC3-II 在 b 处理下表达无明显变化，且使用 Baf A1 后无明显积聚，提示自噬流的降低；c 组，LC3-II 在 c 处理下表达升高，使用 Baf A1 后未见明显积聚，提示自噬被抑制。LC3 检测的注意点目前的 LC3 抗体所检测的抗原表位都位于 LC3 的 N 端，由于 PE 基团结合可能导致 N 端区域的构象变化，使得抗体对 LC3-II 的亲和性更高，所以 LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I 对反复冻融更为敏感，也更易在 SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因，在半定量时，除了使用 LC3-II/LC3-I 的比值外，也有科学家使用 LC3-II 与管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值进行半定量。LC3 是一个膜相关蛋白作为脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解后，对其进行冰上短暂超声，促进蛋白的溶解，将 LC3 从膜上解离。超声方法：使用 35%-40% 的  功率进行 3 次超声脉冲，每次超声时间 10 秒, 每次超声之间停顿 10 秒，不同的仪器可以调整 功率水平在 200W 左右。如没有细胞超声仪，可使用 1 mL 注射器（带针头），通过反复抽吸的方式达到类似于超声的效果。LC3-I 和 LC3-II 是小分子蛋白LC3-I 的分子量约 16KD，由于 LC3-II 接合了 PE 基团，所以理论上，LC3-II 的分子量比 LC3-I 更高。但是，由于带负电的 PE 改变了 LC-II 的性质，使其疏水性更强，导致其在电泳中迁移率更高，所以，LC3-II 在电泳后，停留在了更小分子量（约 14KD）处。小分子量、LC3-I 与 LC3-II 仅有 2KD 差异，在 WB 中需注意：· 使用高浓度分离胶（～15%，确认 Tris 缓冲液的 pH 值）进行分离；· 转膜时，使用小孔径 0.22um 转印膜，湿转 70V 1.5 h 即可。对于半干转（如 Trans-Blot Turbo System），则可使用 2.5A 7 min。自噬是一个「流动」的过程，目前，检测自噬流的方法有很多，除了 Western blot 外，还有电镜、长寿命蛋白降解实验，mRFP-GFP-LC3 双荧光系统等等，每一种实验方法都有其优缺点，所以，需根据实验目的选择合适的实验方法，或者使用多个实验方法进行交叉论证，才能得到可靠的结论。  与我们联系：1、如您对我们的服务感兴趣，可以下载产品资料中的研究方案模板（_lists_sort_3.shtml）进行填写，并发送至我们的官方邮箱：[email protected]，我们将据此为您快捷报价。2、客服QQ：31536679153、客服微信：177143457574、欢迎您访问我们的官网：www.biornscience.com 我们可以为您提供的实验服务有（包含但不限于，点击网址可直接访问查看详情）：     1、动物疾病模型制备：_read_id_128.shtml     2、整体课题实验外包：_read_id_130.shtml     3、动物行为学实验：_read_id_149.shtml     4、western blot实验（全长marker整膜抗体孵育）：_read_id_129.shtml     5、ceRNA网络/lncRNA/circRNA/miRNA相关研究：_read_id_138.shtml     6、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒转染：_read_id_137.shtml     7、荧光素酶报告基因实验：_read_id_189.shtml     8、MTT、CCK8、SRB、克隆形成、EdU等细胞增殖检测实验：_read_id_176.shtml     9、裸小鼠移植瘤、普通小鼠荷瘤、癌转移动物模型：_read_id_203.shtml    10、原代细胞提取、培养基相关实验：_read_id_151.shtml    11、免疫荧光实验：_read_id_139.shtml    12、划痕实验：_read_id_133.shtml    13、ELISA实验：_read_id_152.shtml    14、PCR实验：_read_id_142.shtml    15、细胞铁死亡相关研究实验：_read_id_204.shtml    16、各类细胞实验：_read_id_193.shtml    17、原位杂交（FISH）：_read_id_192.shtml    18、免疫组化实验：_read_id_190.shtml    19、流式细胞术检测细胞亚型：_read_id_184.shtml    20、流式细胞术检测巨噬细胞极化：_read_id_183.shtml    21、活性氧ROS检测：_read_id_182.shtml    22、自噬相关实验及自噬流检测：_read_id_179.shtml    23、小管形成实验：_read_id_178.shtml    24、EdU细胞增殖实验：_read_id_177.shtml    25、TUNEL凋亡染色：_read_id_175.shtml    26、免疫共沉淀实验（coip）：_read_id_154.shtml    27、流式细胞术检测细胞周期：_read_id_146.shtml    28、流式细胞术检测细胞凋亡：_read_id_145.shtml    29、各类病理切片染色：_read_id_143.shtml    30、克隆形成实验：_read_id_134.shtml    31、蛋白泛素化检测：_read_id_141.shtml    32、蛋白乙酰化检测：_read_id_180.shtml    33、流式细胞术检测小胶质细胞极化：_read_id_148.shtml    34、流式细胞术检测T细胞极化：_read_id_147.shtml    35、transwell实验：_read_id_144.shtml    36、细胞焦亡相关实验：_read_id_140.shtml    37、ChIP实验：_read_id_187.shtml    38、EMSA实验：_read_id_188.shtml    39、RNA pulldown实验：_read_id_181.shtml    40、GST pulldown实验：_read_id_191.shtml    41、扫描电镜、透射电镜实验：_read_id_196.shtml    42、mTOR通路相关研究：_read_id_162.shtml    43、JAK-STAT通路相关研究：_read_id_161.shtml    44、HIF-1通路相关研究：_read_id_159.shtml    45、Hedgehog通路相关研究：_read_id_157.shtml    46、炎症小体相关研究：_read_id_160.shtml    47、凋亡通路相关研究：_read_id_156.shtml    48、Hippo通路相关研究：_read_id_158.shtml    49、EGFR通路相关研究：_read_id_155.shtml    50、NF-κB通路相关研究：_read_id_163.shtml    51、wnt/β-catenin通路相关研究：_read_id_168.shtml    52、PI3K-AKT通路相关研究：_read_id_169.shtml    53、JNK通路相关研究：_read_id_171.shtml    54、TGFβ-SMAD通路相关研究：_read_id_172.shtml    55、自噬通路相关研究：_read_id_173.shtml    56、ERK通路相关研究：_read_id_205.shtml